ההבחנה בין חתול זכר לנקבה יכולה להיעשות באמצעים שונים. אחד הדרכים הנפוצות היא על ידי ניתוח גופני. חתולים זכרים לרוב מתאפיינים במין זרע, המכונה "טיס", הממוקם בפי הטיס. הטיס הוא חלק חיוני מערות השייקה, והוא משמש להפריה. חתולים נקבות, לעומת זאת, אינן נושאות טיס ולרוב יש להן פי חתוליות.

בנוסף, חתולים זכרים לרוב נוטים לעשות "תלוי" (לעקור את השיער) בזמן הטיהור, אך זה לא נורמה של זה, מרבית חתולים זכרים בעלי אפטורים של טיס, אך לא קיים טלאי.

בשביל לקבוע את המין של חתול, ישנן מספר שיטות:

• בדיקת המין באמצעות חקירה רפואית: רופא חיות מסוגל לבדוק את המין של החתול בעזרת חקירה רפואית. השיטה כוללת את הליכי חקירה כמו מעקב אחר רמות ההורמונים, בדיקת החתול, וכן.

• בדיקת האיברים הפנימיים: חתול זכר בדרך כלל ישחק וישאיר זיבוב, בעוד חתול נקבה ישחק וישאיר זיבוב קטן.

• בדיקת הצורה של השפך: חתול זכר ישחק וישאיר שפך, בעוד חתול נקבה ישחק וישאיר פתח תפוצץ.